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| 1 | 旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建显示文摘为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因 ,采用酸性异硫氰酸胍 酚 氯仿一步法提取新生幼虫总RNA ,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA ,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA ,用CHROMASPIN 40 0柱离心层析纯化后 ,与载体λZAPExpress连接。体外包装后得到中国猪旋毛虫 (Trichinellaspiralis)分离株新生幼虫cDNA文库。文库容量为2 .0× 10 6,重组率为 98.6 % ,插入片段长度在 0 .4× 10 3— 2 .0× 10 3bp。 | 刘明远 付宝权 卢强 吴秀萍 姚春雨 宇丽 窦兰清 P.Boireau | 2001 | 中国兽医科技2001，31，3： | 24 |
| 2 | 旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究显示文摘目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p4 6kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。 方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以 2 0 μg/只的剂量分 3次免疫小鼠后 ,攻击感染旋毛虫肌幼虫 2 0 0条 /只 ,检查旋毛虫 7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染 35d的肌幼虫数并计算减虫率 ,同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果 WN10免疫小鼠后获得旋毛虫 7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为 6 4 .2 8%和 6 1.2 1% ,均与感染对照组和佐剂对照组差异显著 ;获得雌虫产新生幼虫的减虫率为 16 .4 6 % ,与感染对照组和佐剂对照组差异不显著 ;WN10免疫组小鼠在第 3次免疫后 1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG ,在攻击感染旋毛虫 9周后仍维持在较高水平。 结论 编码旋毛虫新生幼虫 p4 | 原丽红 付宝权 刘明远 张亚兰 高飞 吴秀萍 李莲瑞 林本夫 卢强 陈启军 P.Boireau | 2005 | 中国人兽共患病杂志2005，21，3： | 11 |
| 3 | 旋毛虫肌幼虫p43cDNA的克隆及鉴定显示文摘目的克隆旋毛虫肌幼虫p43cDNA并对其表达的融合蛋白酶活性进行鉴定与分析。方法用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因,克隆到pMD-18T载体,转化至大肠埃希菌NovaBlue,序列测定后克隆到原核表达载体pET28a并转入表达菌DE3中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后提取包涵体并复性,通过降解双链λDNA测定其融合蛋白脱氧核糖核酸酶II(DNase II)活性。结果成功克隆到p43 cDNA序列,该cDNA序列与美国发表的存在两个核苷酸的变异,分别为第210位的C变为T,第604位的A变为G。基于3名研究者从旋毛虫T.spiralis美国分离株获得的序列相同、6名国内研究者(含本课题组)从T.spiralis中国分离株获得的序列也相同,由此可以确定这两个核苷酸的变异为T.spiralis中国分离株特异性和特征性单核苷酸多态性(SNP)标记。p43重组蛋白能够降解双链λDNA,表明其有DNase II酶活性。结论成功克隆到p43cDNA,T.spiralis中国分离株的p43cDNA具有两个SNP标记,其表达的重组蛋白具有DNase II酶活性。 | 郭恒 李莲瑞 刘明远 吴秀萍 孙树民 付宝权 高长玲 卢强 陈启军 P.Boireau | 2005 | 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2005，23，6： | 8 |
| 4 | 旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的表达与抗原性分析显示文摘目的 对旋毛虫新生幼虫p460 0 0抗原基因进行原核表达并检测重组抗原的抗原性。 方法 利用聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,克隆到原核表达载体 pET 2 8a ,构建重组表达质粒 ,经酶切及测序鉴定后转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析表达产物。 结果 SDS PAGE结果显示表达产物的分子量约为Mr 480 0 0 ,与理论值相符。ELISA和Westernblotting结果表明 ,重组蛋白可被旋毛虫感染的猪血清和兔抗重组蛋白血清识别 ;兔抗重组蛋白血清可识别旋毛虫新生幼虫抗原Mr 460 0 0蛋白。 结论 成功表达了旋毛虫新生幼虫p460 0 0抗原基因 ,重组抗原具有良好的抗原性。 | 原丽红 付宝权 刘明远 高飞 张亚兰 吴秀萍 林本夫 李莲瑞 卢强 陈启军 P.Boireau | 2005 | 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2005，23，1： | 7 |
| 5 | 旋毛虫新生幼虫期特异性T668全长cDNA的克隆及序列分析显示文摘利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA片段 T6 6 8- SS2作为核酸探针 ,在新生幼虫 c DNA文库中筛选出 10个阳性克隆。序列测定及分子生物学软件分析表明 ,克隆 G10 - 6的 c DNA片段全长 16 0 0 bp,含 12 90 bp的开放阅读框架 ,编码 1个由 4 30个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量理论推导值为 4 6 84 0 ,等电点 (PI)为 9.6 5。主导氨基酸为Ser(11.39% )和 Thr(10 .93% )。开放阅读框架中具有丝氨酸蛋白酶保守功能区及酶活性位点结构 ,其 N末端的信号肽及 2个糖基化位点表明 ,其为分泌性糖蛋白 ,预示其可能在细胞外起着重要作用。DNA同源性分析表明 ,该 c DNA为一新的 c DNA分子。 | 刘明远 付宝权 吴秀萍 卢强 任瑞文 姚春雨 牛廷献 张西臣 黎诚耀 P.Boireau | 2002 | 中国兽医学报2002，22，1： | 7 |
| 6 | 旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的克隆及序列分析显示文摘应用旋毛虫感染猪血清 ,对旋毛虫新生幼虫 c DNA文库进行了免疫筛选。对阳性克隆 p BK- CMV- WN10的序列分析结果表明 ,c DNA全长为 135 2 bp,含有 1个 12 18bp的完整的开放阅读框架 (ORF) ,编码的多肽由 4 0 6个氨基酸残基组成 ,其相对分子质量理论推导值为 4 5 90 0 ,等电点为 5 .4 3,N末端的信号肽及糖基化位点 (NCS)表明其可能为分泌性糖蛋白 ,氨基酸序列 19~ 15 6与 15 8~ 2 95为重复区域 ,相似性为 74 % ,C末端有 1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域 ,但旋毛虫 p4 6 0 0 0抗原与其他线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白结构有很大差异 ,可能已经失去半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的功能。 PCR结果显示 ,从旋毛虫新生幼虫、肌幼虫、3日龄成虫和 5日龄成虫 c DNA中均扩增出此基因 。 | 付宝权 吴秀萍 刘明远 张亚兰 原丽红 李莲瑞 卢强 陈启军 P.Boireau | 2005 | 中国兽医学报2005，25，1： | 7 |
| 7 | 旋毛虫肌幼虫强反应原性抗原基因的筛选及生物学特性分析显示文摘应用感染旋毛虫60 d猪血清为抗体探针,对旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫筛选,获得旋毛虫肌幼虫期强反应原性抗原基因,利用生物学信息网站(NCBI、BLAST等)及其相关软件(DNA star等)对获得的基因进行序列分析。结果表明:筛选约2.5×105个重组噬菌体,获得13个阳性克隆,有6个克隆为同一个基因,编码蛋白与染色体结构维持蛋白(SMC蛋白,structural maintenance of chromosome proteins)同源性为48.1%,在免疫筛选中均有较强的反应信号;有3个克隆为同一个已知基因(AAF63473),编码蛋白与丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor)同源性为99%,在免疫筛选中反应信号次之;还有2个为同一个基因,与旋毛虫线粒体(Mitochondrion ofTrichinella spiralis)DNA有较高的同源性(同源性为87.7%),编码核糖体大亚基RNA,其他2个为未曾报道过的新基因,编码不同的未知蛋白,这4个克隆在免疫筛选过程中反应信号相对较弱。得到的2个强反应原性的旋毛虫肌幼虫cDNA分子,其中相对信号最强cDNA分子编码SMC蛋白,另一个编码丝氨酸蛋白酶抑制因子,二者有望用于旋毛虫病的诊断候选抗原基因。 | 吴秀萍 赫荣华 邹洪斌 杨志东 P.Boireau 刘明远 | 2008 | 吉林农业大学学报2008，30，2： | 6 |
| 8 | 旋毛虫肌幼虫cDNA文库的免疫筛选及初步分析显示文摘用旋毛虫感染猪血清对旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行了免疫筛选,从1 6×105个重组噬菌体中筛选出21个阳性克隆。阳性克隆的测序结果表明:有9个克隆为未曾报道过的新基因;有9个克隆不含有开放阅读框架(ORF),与旋毛虫线粒体DNA同源,编码核糖体大亚基RNA;3个克隆为旋毛虫已知基因,其中克隆ML12,34与Serineproteaseinhibitor[Trichinellaspiralis](AAF63473)同源性为99%,克隆ML42与HypotheticalOFR17 20[Trichinellaspiralis](AAB48489)同源性为99%,与21kDExcretory secretoryprotein[Trichinellapseudospiralis](AAF79206)同源性为90%,这为进一步研究基因重组抗原奠定了基础。 | 付宝权 原丽红 张亚兰 吴秀萍 李莲瑞 卢强 刘明远 陈启军 P.Boireau | 2004 | 吉林农业大学学报2004，26，3： | 6 |
| 9 | 旋毛虫5日龄成虫期特异性基因片段的克隆及鉴定显示文摘利用差减抑制杂交 (SSH)技术 ,以旋毛虫 5日龄成虫的cDNA为试验方 (tester) ,以肌幼虫 + 3日龄成虫的cDNA为驱动方 (driver) ,制备 5日龄成虫差减cDNA ,并与 pT Adv载体相连接 ,转入大肠埃希氏菌TOP 10F。以试验方的差减cDNAPCR产物 +未差减cDNA为试验方探针 ,以驱动方的差减cDNAPCR产物 +未差减cDNA为驱动方探针 ,对 5日龄成虫差减cDNA克隆进行初步筛选 ,对筛选到的阳性克隆进一步用southernblot进行鉴定 ,并对其测序 ,进行序列分析。结果表明 ,获得 1个大小为 464bp的旋毛虫 5日龄成虫期特异性cDNA片段 ,经BLAST软件分析表明 ,该序列是 1个未见报道的旋毛虫基因序列片段 ,可能编码 1种表皮胶原蛋白。这为旋毛虫 5日龄成虫期特异性基因全长序列的钓取、分析及鉴定奠定了基础。 | 付宝权 刘明远 王锋 吴秀萍 卢强 黎诚耀 窦兰清 P.Boireau | 2001 | 中国兽医科技2001，31，11： | 5 |
| 10 | 旋毛虫3日龄成虫cDNA文库的免疫筛选显示文摘以旋毛虫感染猪血清为抗体探针 ,对旋毛虫 3日龄成虫 c DNA文库进行免疫筛选 ,将获得的阳性克隆进行测序 ,用分子生物学软件对所得 c DNA序列进行序列分析。结果从 4× 10 5个重组噬菌体中共获得 33个阳性克隆。序列分析结果显示 :共发现新 c DNA序列 16个 ,已知 c DNA序列 4个。其中阳性克隆 Zh8,9,10 ,12 ,13,14 ,2 0 ,2 6 ,2 8,2 9,36 ,5 4 ,6 8,70编码丝氨酸蛋白酶。通过免疫学筛选直接获得了具有免疫反应原性的阳性 c DNA克隆 。 | 张亚兰 付宝权 刘明远 原丽红 吴秀萍 李莲瑞 卢强 陈启军 P.Boireau | 2004 | 中国兽医学报2004，24，4： | 5 |
| 11 | 2个旋毛虫新生幼虫期特异性相似cDNA的克隆及序列分析显示文摘利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA探针 ,从新生幼虫 c DNA文库中筛选出 2个相似的旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA克隆 ,分别命名为 N5和 N10 ,N5长度为 12 5 0 bp,N10长度为 12 33bp。 NCBI Blast检索表明 ,2个c DNA全长序列均为旋毛虫新基因序列。DNASIS分析表明 ,N5与 N10的开放阅读框架分别为 10 14、10 17bp,编码338、339个氨基酸 ,推导的成熟蛋白氨基酸序列均为 32 1个氨基酸残基 ,相对分子质量推导值分别为 35 30 0和 354 0 0。 2个氨基酸序列中 N端均包含有一信号肽序列 ,可能为分泌性蛋白。NCBI Blast及 Inter Proscan检索表明 ,以上2个氨基酸序列均含有 型核酸酶的功能结构域 ,均编码 型核酸酶 (DNase ) ,且与已报道的旋毛虫包囊形成相关蛋白 P4 3(经鉴定也为 DNase )同源性最高。目前已有的试验结果证实 ,P4 3并未直接参与包囊的形成 ,而是一种与P4 3蛋白同源性非常高的蛋白参与了旋毛虫包囊的形成。由于 N5与 N10为旋毛虫新生幼虫期特异性表达基因 ,也就是在旋毛虫包囊形成的时期表达 ,而且与 P4 3具有较高的同源性 ,并均编码 DNase 蛋白 ,因此 N5。 | 刘明远 吴秀萍 付宝权 卢强 姚春雨 李莲瑞 P.Boireau | 2004 | 中国兽医学报2004，24，6： | 4 |
| 12 | 旋毛虫新生幼虫期特异性T_(314)全长cDNA的克隆及表达显示文摘利用 PCR将旋毛虫新生幼虫期特异性全长 T31 4c DNA的信号肽祛除后重组到原核表达载体 p ET- 2 8a。将重组质粒 p ET2 8- T31 4转入克隆菌 DH5α和表达菌 DE3,分别提取质粒进行酶切、测序鉴定。用 IPTG诱导培养重组表达菌DE3,做菌体裂解物外源基因表达产物的 SDS- PAGE分析。将重组质粒表达的融合蛋白免疫家兔制备抗血清 ,采用Western blot检测 T31 4c DNA在旋毛虫不同发育时期的表达情况及其天然表达产物的相对分子质量。测序结果显示 :外源 T31 4c DNA的 PCR产物在重组质粒 p ET2 8- T31 4中阅读框架正确 ;SDS- PAGE分析结果显示 :经 IPTG诱导后转化菌 DE3的裂解产物与对照菌相比出现了 1条相对分子质量约为 390 0 0的新条带 ,大小与外源 c DNA融合蛋白的理论推导值 3880 0相符 ;Western blot检测结果显示 :T31 4c DNA的天然表达产物仅存在旋毛虫新生幼虫 ,不存在于成虫与肌幼虫 ,且相对分子质量大小与其在原核重组质粒中表达产物相同。 | 吴秀萍 刘明远 陈启军 卢强 付宝权 姚春雨 P.Boireau | 2003 | 中国兽医学报2003，23，2： | 4 |
| 13 | 旋毛虫肌幼虫p53cDNA的克隆及鉴定显示文摘根据GenBank中旋毛虫53000抗原基因的序列设计引物,用PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p53 cDNA,将其克隆到pMD-18T载体,转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析,结果表明,克隆到1176bp的p53 cDNA,共编码391个氨基酸。序列分析表明,p53 cDNA序列与GenBank中的旋毛虫p53基因序列相比共有12个核苷酸发生改变,二者的同源性为98%,所编码蛋白质氨基酸序列的同源性为98%。将其克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star(DE3),经IPTG诱导表达后获得约48000的重组蛋白。Western blotting检测证实,p53重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别,具有很好的抗原性。 | 孙树民 吴秀萍 王学林 付宝权 卢强 李莲瑞 郭恒 P.Boireau 陈启军 刘明远 | 2007 | 中国兽医学报2007，27，4： | 3 |
| 14 | 旋毛虫FYVE锌指结构蛋白基因的克隆及表达显示文摘用旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库中的T5 4克隆作为核酸探针 ,对旋毛虫成虫和新生幼虫混合cDNA文库进行筛选 ,获得 1个全长 14 6 4bp的cDNA分子。该cDNA含有 1个 12 90bp的开放阅读框架 (ORF) ,Blastn同源性分析表明 ,与其它已知生物基因序列无明显的同源性 ,为一新的cDNA。该ORF编码 1个 42 9个氨基酸残基组成的多肽 ,其分子质量理论推导值为 49.9ku ,等电点为 5 .6 ,在 12— 14及 10 3— 10 5氨基酸残基处分别有 2个糖基化位点NLS及NVS ,在C末端 344— 40 9氨基酸残基处有 1个FYVE锌指结构域 (ProfilePS5 0 178)。Blastp同源性分析表明 ,与广东管圆线虫 (Angiostrongyluscantonensis) 6 6 .0ku蛋白 ( gi/ 1743430 )同源性最高 ,为 39.0 %。在此基础上对旋毛虫FYVE锌指结构重组蛋白进行了表达 ,表达蛋白占菌体蛋白的 2 4%。 | 孟学平 付宝权 卢强 吴秀萍 王锋 牛廷献 黎诚耀 刘明远 P.Boireau | 2001 | 中国兽医科技2001，31，12： | 2 |
| 15 | 旋毛虫感染小鼠对p46000重组抗原的抗体应答显示文摘分别以旋毛虫肌幼虫ES抗原和p46000重组蛋白作为抗原,对小鼠人工感染旋毛虫后的抗体应答进行了ELISA检测。结果表明,以肌幼虫200条/只经口感染小鼠后,肌幼虫ES抗原在感染后9d可检出抗体,并于感染后35~42d达到最高水平;应用重组抗原检测时,感染后10d可检出抗体,抗体水平略低于用ES抗原,但是其消长规律基本一致.而且与阴性血清相比差异明显;抗体在117d后仍维持于较高水平。 | 原丽红 付宝权 刘明远 林本夫 张亚兰 吴秀萍 卢强 陈启军 P.Boireau | 2006 | 中国兽医学报2006，26，1： | 1 |
| 16 | 旋毛虫新生幼虫WN1抗原基因的克隆及表达显示文摘应用旋毛虫人工感染猪血清对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,对阳性克隆WN1序列进行生物信息学分析。结果表明,WN1cDNA全长为474bp,含有1个354bp的完整的开放阅读框架(ORF),编码的多肽由117个氨基酸残基组成,其相对分子质量理论推导值为13200,等电点为4.25,N-末端的信号肽表明其可能为分泌性蛋白。GenBank数据库检索结果显示,此序列为一个新基因的全长cDNA。经PCR扩增WN1基因,将其克隆到原核表达载体pET28a,重组质粒经鉴定后,转化大肠杆菌BL21star(DE3)并诱导表达出相对分子质量为15000的重组蛋白,与理论设计完全相符。 | 高长玲 付宝权 刘明远 郭桓 孙树民 吴秀萍 卢强 陈启军 P.Boireau | 2005 | 中国兽医学报2005，25，3： | 1 |
| 17 | 旋毛虫肌幼虫p45cDNA的克隆及鉴定显示文摘目的本研究根据GenBank中旋毛虫45kDa抗原基因的序列设计引物,采用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p45cDNA,并克隆到pMD-18T载体,转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析。获得827bp的p45cD-NA。该序列与GenBank中的旋毛虫p45基因序列相比共有1个核苷酸发生改变,二者的同源性为99%,其编码蛋白质由268个氨基酸组成,与45kDa抗原的同源性为99%。将p45cDNA克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star(DE3)后,经IPTG诱导表达出约30kDa的重组蛋白。Western-blot检测表明,p45重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别,具有良好的抗原性。 | 孙树民 吴秀萍 付宝权 王学林 郭恒 于申业 邓洪宽 刘马峰 P.Boireau 刘明远 | 2008 | 中国人兽共患病学报2008，24，5： | 0 |
| 18 | 旋毛虫新生幼虫期特异性基因N10的表达及鉴定显示文摘根据旋毛虫新生幼虫期特异性基因pBK-CMV-N10序列设计引物,利用PCR技术将基因N10的信号肽去除后,用T/A法克隆到pMD-18T载体,转化至大肠杆菌NovaBlue,经鉴定及序列测定,结果显示成功克隆到N10基因。将重组质粒pMD-18T-N10进行酶切后连接到原核表达载体pET-28a中,重组质粒经鉴定后转化大肠杆菌BL21star(DE3),用IPTG诱导表达出与理论相符的融合蛋白,相对分子质量为38700,诱导4h的表达量占菌体总蛋白量的15%。从N10重组蛋白提取可溶性融合蛋白,对其生物学特性初步鉴定结果表明,具有类似脱氧核糖核酸酶的活性。 | 高长玲 刘明远 郭恒 孙树民 付宝权 崔国祯 卢强 陈启军 P.Boireau | 2006 | 中国兽医学报2006，26，3： | 0 |
| 19 | 旋毛虫T3223-6 cDNA的表达及鉴定显示文摘利用PCR技术将T 3223-6 cDNA扩增克隆到原核表达载体pET-28a,将重组质粒转入克隆菌N ova-b lue,提取质粒进行酶切和测序鉴定后转入表达菌BL 21star(DE3)。用1 mM IPTG诱导培养重组表达菌,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析,检测重组蛋白的表达情况。用旋毛虫感染猪血清和正常血清,通过w estern b lotting检测重组蛋白的反应原性。结果表明:经IPTG诱导后重组转化菌的裂解产物出现44 kD左右的表达带,大小与理论值相符;w estern b lotting检测结果显示重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别,具有反应原性。 | 龙民慧 付宝权 刘明远 孙树民 郭恒 卢强 P.Boireau | 2005 | 中国畜牧兽医2005，32，10： | 0 |
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