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| 1 | A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient, High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants显示文摘CRISPR/Cas9 染色体指向系统被用于许多种类。然而,为植物报导的 mostCRISPR/Cas9 系统能仅仅修改一个或一些指向地点。这里,我们报导一个柔韧的 CRISPR/Cas9 向量系统,利用植物 codon 优化了 Cas9 基因,为方便、高效率的复合染色体在 monocot 和 dicot 植物编辑。我们设计了基于 PCR 的过程很快产生多重 sgRNA 表达式盒子,它能在一个轮由金门结扎或吉布森汇编克隆被装配进二进制 CRISPR/Cas9 向量。与这个系统,我们与 85.4% 变化评估的一般水准在米饭编辑了 46 个目标地点,主要在 biallelic 和同型结合的地位。我们推想在米饭的大约 16% 同型结合的变化通过相应基于再结合的修理跟随的非相应的加入结束的机制被产生。我们也获得了一致 biallelic,在 Arabidopsis T 1 植物的异质接合、同型结合、妄想的变化。在米饭和 Arabidopsis 的指向的变化是可继承的。我们在 T 0 米饭和 T 1 由同时的指向的 Arabidopsis 植物多重(多达八) 一个基因家庭,在一条 biosynthetic 小径的多重基因,或在单个基因的多重地点的成员。这个系统为为基本研究和基因改进在植物学习多重基因和基因家庭的功能提供了一个万用的工具箱。 | Xingliang Ma Qunyu Zhang Qinlong Zhu Wei Liu Yan Chen Rong Qiu Bin Wang Zhongfang Yang Heying Li Yuru Lin Yongyao Xie Rongxin Shen Shuifu Chen Zhi Wang Yuanling Chen Jingxin Guo Letian Chen Xiucai Zhao Zhicheng Dong Yao-Guang Liu | 2015 | Molecular Plant2015，8，8： | 272 |
| 2 | Precise Editing of a Target Base in the Rice Senome Using a Modified CRISPR/Cas9 System显示文摘 | Yuming Lu Jian-Kang Zhu | 2017 | Molecular Plant2017，10，3： | 87 |
| 3 | 植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展显示文摘基因组编辑技术已经在多个模式植物、动物以及其他生物中得到成功应用。基因组编辑是利用序列特异核酸酶(Sequence-specific nucleases,SSNs)在基因组特定位点产生DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs),从而激活细胞自身修复机制——非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(Homologous recombination,HR),实现基因敲除、染色体重组以及基因定点插入或替换等。锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)、TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9)系统是最主要的3类SSNs。ZFN和TALEN是利用蛋白与DNA结合方式靶向特定的基因组位点,而最新的CIRISPR/Cas9系统则是利用更简单的核苷酸互补配对方式结合在基因组靶位点,其构建简单、效率更高效,因而促进了基因组编辑在植物中的广泛应用。利用基因组编辑技术除了实现植物基因定点突变外,还可以将SSNs的DNA结合域与其他功能蛋白融合,实现基因的靶向激活、抑制和表观调控等衍生技术。本文从基因组编辑技术的原理与优势、SSNs组成及构建方法、基因组编辑及衍生技术在植物中应用、优化SSNs突变效率和减少脱靶突变方法等方面进行了系统介绍,并对未来需要迫切解决的一些问题进行了分析和展望。 | 单奇伟 高彩霞 | 2015 | 遗传2015，37，10： | 69 |
| 4 | CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展显示文摘基因编辑技术的发展与应用为植物功能基因研究和作物遗传改良提供了重要的技术支撑。近年诞生的CRISPR/Cas 基因编辑系统(主要包括 CRISPR/Cas9 和 CRISPR/Cas12a)与其他的基因编辑技术相比,具有操作简单、效率高等优势,因此在动植物中均得到广泛应用。本文结合 CRISPR/Cas 基因编辑技术体系的发展历史及最新研究进展,着重介绍了该技术在植物领域中的应用范围和发展方向,以及基因编辑植物的靶点分析方法;对目前CRISPR/Cas 基因编辑技术体系存在的问题进行了分析并提出了改进策略。 | 刘耀光 李构思 张雅玲 陈乐天 | 2019 | 华南农业大学学报2019，40，5： | 56 |
| 5 | High-Efficiency Genome Editing in Arabidopsis Using YAO Promoter-Driven CRISPR/Cas9 System显示文摘 | Yan, Liuhua Wei, Shaowei Wu, Yaorong Hu, Ruolan Li, Hongju Yang, Weicai Xie, Qi | 2015 | Molecular Plant2015，8，12： | 50 |
| 6 | Rapid Decoding of Sequence-Specific Nuclease- Induced Heterozygous and Biallelic Muta'dons by Direct Sequencing of PCR Products显示文摘 | | 2015 | Molecular Plant2015，8，8： | 36 |
| 7 | DRISPR/Cas9 Platforms for Genome Editing in Plants: Developments and Applications显示文摘 | Xingliang Ma Qinlong Zhu Yuanling Ghen Yao-Guang Liu | 2016 | Molecular Plant2016，9，7： | 39 |
| 8 | CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用显示文摘CRISPR/Cas9系统是近年发展起来的、由导向RNA介导的基因组定向编辑技术。总结了CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展历程,并综述了其在作物遗传育种研究中的多方面应用。CRISPR/Cas系统是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统,以消灭外来质体或者噬菌体。根据Cas蛋白组分及氨基酸序列不同,已发现的CRISPR/Cas系统可以分为3种不同类型,Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中,Ⅱ型是以Cas9蛋白及导向RNA为核心组份,组成较为简单,是目前经过改造用于开发基因组定向编辑技术的主要类型。自CRISPR/Cas9技术体系首先在人类与动物细胞系中建立后,经过改造的CRISPR/Cas9系统被迅速地应用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中。CRISPR/Cas9与ZFNs或TALENs一样都是通过自身的核酸内切酶活性引起靶位点DNA序列双链断裂,然后通过非同源末端连接或同源重组介导的修复2种方式引入突变。至今,在多种作物中已实现诱导产生多种定点突变(包括插入、缺失或修饰等),并可获得较高的突变诱导率和可稳定遗传的基因组编辑后代植株。与ZFNs或TALENs技术相比,CRISPR/Cas9技术可以实现对基因组中多个靶基因同时进行编辑,从而可以用来修饰同一基因家族中的不同成员或同一代谢途径中的不同调控基因,为其一大优势。由于CRISPR/Cas9技术具有突变诱导率高、成本低、易于操作及可以多重基因编辑等特点,已成为具有广阔应用前景的作物遗传改良与育种研究的分子操作系统。CRISPR技术除了可以对基因组中不同靶基因进行定向编辑以外,还可以广泛地应用于基因表达调控研究、细胞定位运输系统研究及新型RNA沉默系统构建等方面。基因组编辑技术是继转基因技术之后人类对生物进行遗传操作的又一个革命性技术。但是,与转基因技术相比,CRISPR/Cas9基因组编辑技术操作更加简单、快捷。应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行育种可以不引入外源基因,在进行基因组编辑之后可以不留下转基因的痕迹,从而导致定义转基因生物的不明确性,因此,政府监管部门是否应该按照转基因的管理办法来监管CRISPR/Cas9技术的应用尚有待决定。 | 景润春 卢洪 | 2016 | 中国农业科学2016，49，7： | 34 |
| 9 | To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering显示文摘在他们的生命周期的功课期间,植物经历位于 juvenile-to-adult 和 adult-to-flowering 阶段转变下面的各种各样的词法、生理的变化。是向它的新生命周期的开始的植物的粘性的关键步到花到花。除了以前揭示的内在的基因节目,外长的暗示,和内长的暗示,小非编码的 RNA 的一个班, microRNAs (miRNAs ) ,在由集成到已知的 flowering 小径作决定到花的植物起一个关键作用。这评论在决定如此的一个关键过程与很多预定 miRNAs 的一个焦点加亮年龄依赖者 flowering 小径。主要在年龄小径外面存在的另外的 miRNAs 的贡献也被讨论。学习决定花的 miRNAs,他们的相互作用,和应用程序的途径被介绍。 | Sachin Teotia | 2015 | Molecular Plant2015，8，3： | 30 |
| 10 | CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用显示文摘作为传统基因工程育种技术,转基因技术在植物分子育种工作中的应用受到技术本身缺陷及其他风险因素的限制。CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发展起来的一种基因组定向编辑技术。本研究介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术的基本原理和研究进展,分别比较分析了CRISPR/Cas9系统与前两代基因编辑技术(ZFNs和TALENs)和传统转基因技术之间的差异。至今为止,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在多种植物中实现了定点突变诱导(插入,缺失或修饰等)。由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点,CRISPR/Cas9系统作为一项高效植物遗传改良和育种研究的分子操作技术手段,应用前景十分广阔。 | 姚祝平 程远 万红建 李志邈 叶青静 阮美颖 王荣青 周国治 杨悦俭 | 2017 | 分子植物育种2017，15，7： | 27 |
| 11 | CRISPR/Cas系统在植物基因组编辑中的应用显示文摘在基因组水平上进行植物基因人工改造对农作物的改良具有重要意义。一直以来,科学家都未发现有效的植物基因组编辑的方法。最近发现的CRISPR/Cas系统因其简易和有效性被广泛应用于包括植物在内的多种生物的基因组编辑中。CRISPR/Cas系统仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变。目前CRISPR/Cas系统已成功在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、甜橙(Citrus sinensis)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)以及苔藓植物地钱(Marchantia polymorpha)等植物中实现了定点基因组编辑。综述将对CRISPR/Cas系统在植物中的最新研究进行全面的总结和讨论。 | 瞿礼嘉 郭冬姝 张金喆 秦跟基 | 2015 | 生命科学2015，27，1： | 26 |
| 12 | 应用CRISPR/Cas9技术在杨树中高效敲除多个靶基因显示文摘CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术。本课题组在前期工作中利用该系统在毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中率先实现了对内源基因—八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene dehydrogenase,PDS)基因的定点敲除。为研究靶点的设计和选择对该系统介导的杨树内源基因敲除效率的影响,本文分析了不同单向导RNA(Single-guide RNA,sg RNA)结合毛白杨PDS(Pt PDS)靶基因DNA序列后对突变效率的影响。结果发现sg RNA与靶基因间的碱基错配会导致突变的效率降低,甚至不能突变,其中3′端的碱基配对更为重要。进一步测序分析发现,该系统能同时敲除杨树基因组上两个同源的PDS编码基因(Pt PDS1和Pt PDS2),突变率分别达86.4%和50%。研究证明该系统可快速高效地敲除两个以上的内源基因,获得多重突变体杨树株系。利用该技术,本课题组已获得多个杨树转录因子及结构基因的敲除突变体株系,为将来开展基因功能研究和杨树遗传改良奠定了基础。 | 刘婷婷 范迪 冉玲玉 姜渊忠 刘瑞 罗克明 | 2015 | 遗传2015，37，10： | 26 |
| 13 | 基因组编辑技术在植物基因功能鉴定及作物育种中的应用显示文摘利用生物技术可以对植物基因组进行高效、精准、特异的修饰。锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)、成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9(CRISPR-associated 9)是目前基因组编辑技术应用中的关键工程核酸酶。通过产生DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)激活植物内源修复途径(包括非同源粘性末端连接和同源重组修复),基因组编辑技术可以实现对靶位点的定点突变、缺失或者基因的插入与替换。基因组编辑已经被广泛地应用到各种植物的基因组修饰中,如拟南芥、水稻、烟草等。本文主要概述了基因组编辑技术在植物基因功能鉴定及作物遗传育种中的应用,并对其未来在作物精准改良中需要完善的相关问题进行了探讨。 | 周想春 邢永忠 | 2016 | 遗传2016，38，3： | 26 |
| 14 | Development of japonica Photo-Sensitive Genic Male Sterile Rice Lines by Editing Carbon Starved Anther Using CRISPR/Cas9显示文摘Rice is one of the most important crops as it supports over25%of total caloric intake for humans(Kusano et al.,2015).The world population reached 7.3 billion in 2015 and is projected to reach 8.5 billion in 2030(Word Population Prospects:2015 Revision).To meet the food demands for the everincreasing population with limited arable land,scarce | Quanlin Li Dabing Zhang Mingjiao Chen Wanqi Liang Jiaojun Wei Yiping Qi Zheng Yuan | 2016 | Journal of Genetics and Genomics2016，43，6： | 26 |
| 15 | 香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立显示文摘【目的】建立香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,为在香蕉上利用CRISPR/CAS9技术开展香蕉基因功能研究和香蕉育种工作开辟新的路径。【方法】根据香蕉A基因组八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2确定合适的CRISPR/Cas9靶标序列,选择其中一个位点作为靶标位点,设计包含靶标基因MaPDS序列的sgRNA。利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以pYLg RNA-Lac Z-U6a质粒为模版,Overlapping PCR法构建U6a-sgRNA表达盒,再利用Golden Gate Cloning法将U6a-sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体中,构建以MaPDS为靶标基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。构建的质粒含Cas9p和sgRNA表达盒,其中Cas9p由P_(Ubi)启动子驱动,sgRNA由水稻来源的RNA启动子U6a驱动。将构建好的载体转入农杆菌EHA105,转化香蕉主栽品种巴西蕉胚性细胞悬浮系,获得抗性再生植株。设计PCR引物扩增包含靶标序列的MaPDS序列片段,检测和分析再生植株MaPDS被编辑的情况。【结果】试验选择MaPDS作为CRISPR/Cas9靶标基因,设计一个靶标位点,利用Overlapping PCR法获得了U6a-sgRNA表达盒,利用Golden Gate Cloning法将其克隆到pYLCRISPR/Cas9的Bsa I位点,成功构建了针对MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。经过农杆菌浸染、抗性筛选、抗性胚诱导、萌发及生根,最终获得抗性独立转化株系129个。其中,71个株系出现白化表型,产生白化表型的几率达55%。失绿突变体的出现意味着MaPDS蛋白功能丧失。随机取转化株系中的白化表型株系33个和正常表型株系14个,提取其叶片基因组DNA,扩增含有MaPDS的靶位点片段,序列分析结果表明,白化表型株系的MaPDS靶位点序列发生了基因编辑。主要是在靶位点附近增加1个碱基T或A,或是在靶位点附近或下游发生碱基颠换或转换,出现非靶标位点突变。这些突变形式均能导致MaPDS蛋白翻译错误,从而使MaPDS蛋白丧失功能,表现为白化。转化株系中表型正常植株的MaPDS靶位点序列与野生型一致,未检测到变异。【结论】成功在香蕉体内实现了对内源MaPDS的定点敲除,获得了基因定点敲除的突变体株系,为进一步利用基因编辑技术在香蕉上的应用奠定了基础。 | 胡春华 邓贵明 孙晓玄 左存武 李春雨 邝瑞彬 杨乔松 易干军 | 2017 | 中国农业科学2017，50，7： | 26 |
| 16 | 利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性显示文摘[目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 为靶基因,构建共编辑载体 pC1300-2×35S::Cas9-g^Pita-g^Pi21-g^ERF922 ,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。[结果]在T0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922 突变频率分别为 75%、85%和 65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含 T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代,并从中获得 Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。[结论]利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。 | 徐鹏 王宏 涂燃冉 刘群恩 吴玮勋 傅秀民 曹立勇 沈希宏 | 2019 | 中国水稻科学2019，33，4： | 25 |
| 17 | CRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物基因功能研究及植物改良中的应用显示文摘CRISPR/Cas是发现于细菌和古细菌基因组中的特殊结构,参与细菌和古细菌破坏噬菌体和外源质粒的免疫保护。科学家将II型CRISPR/Cas改造成为一个组装简便、高效和精准的基因组编辑工具,并迅速在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改造中获得广泛应用。本文介绍CRISPR/Cas9技术出现近两年来,在水稻、小麦、高粱、拟南芥、烟草、甜橙等植物中的研究情况,在此基础上对该技术的优点和需要进一步改进的地方提出了看法。 | 曾秀英 侯学文 | 2015 | 植物生理学报2015，51，9： | 22 |
| 18 | 利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻粒长和穗粒数性状显示文摘【目的】基因组定点编辑技术已成为分子育种的重要手段。本研究拟对GS3和Gn1a功能缺失突变对目标性状的改良效应进行分析,以期为培育高产水稻提供理论基础。【方法】利用CRISPR/Cas9系统,以控制粒型基因GS3和控制每穗粒数基因Gn1a为编辑对象,构建了共敲除载体p C1300-2×35S::Cas9-g^(GS3)-g^(Gn1a)a,用农杆菌介导法转化4个优质水稻品种,分析了基因突变的特征和相应农艺性状。【结果】构建的敲除载体成功地实现了对GS3和Gn1a基因的定点编辑。在4个转化受体的T_0代均分别获得了gs3和gs3gn1a的移码突变体。对T_1 代中无选择标记突变体的农艺性状分析表明,突变体gs3和gs3gn1a与野生型相比粒长变长,千粒重增加;突变体gs3gn1a与突变体gs3相比,每穗粒数显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9系统进行水稻基因编辑可以快速改良品种的目标性状,在水稻品种的定向改良方面具有巨大的潜力。 | 沈兰 李健 付亚萍 王俊杰 华宇峰 焦晓真 严长杰 王克剑 | 2017 | 中国水稻科学2017，31，3： | 22 |
| 19 | 利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻Pi21基因的效率分析显示文摘利用CRISPR/Cas9技术,针对Pi21基因的两个靶位点(靶位1和靶位2),构建基因敲除载体,转化水稻品种南粳9108。经PCR鉴定,获得了28株T0代阳性转基因植株。对靶位点酶切检测发现,靶位1突变效率为78.57%,靶位2突变效率为92.86%;靶位1和靶位2同时突变的效率为78.57%,突变效率较高。通过对靶位点进行测序,发现靶位点突变类型较多,包括碱基缺失、碱基插入、碱基缺失后插入其他碱基和大片段DNA缺失等类型。对突变株系进行氨基酸预测,发现大部分株系都存在移码突变现象而使基因突变彻底,少数株系表现为部分氨基酸的缺失或变异。成功敲除了水稻Pi21基因,并对突变效率和类型进行了分析,为进一步验证Pi21基因功能、培育广谱抗稻瘟病的水稻新品系奠定了基础。 | 王芳权 范方军 李文奇 朱金燕 王军 仲维功 杨杰 | 2016 | 中国水稻科学2016，30，5： | 19 |
| 20 | 植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统与突变分析显示文摘基因组定点编辑技术通过可编码核酸酶切割基因组特定位点,进而诱导基因组定点突变。CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)基因组编辑系统由Cas9核酸酶以及sg RNA(Single guide RNA)组成,与其他可编码核酸酶系统如锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)相比具有更简便的操作性和更高的基因组定点编辑效率。目前在植物中已有多例应用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的报道。本文从Cas9基因与sg RNA表达载体的构建策略,获得基因组定点编辑突变体的转化方法、突变的效率和特征、突变的检测方法等方面进行了总结,最后对植物中利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑存在的问题以及发展前景进行了讨论。 | 马兴亮 刘耀光 | 2016 | 遗传2016，38，2： | 18 |
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